همسانه سازی ژن مقاومت به کرم ساقه خوار نیشکر(sesamia spp) در وکتور بیانی گیاهی و بهینه سازی باززایی گیاه نیشکر جهت انتقال ژن bt

نیشکر یکی از مهم ترین گیاهان صنعتی کشور جهت تولید شکر است. راهکارهای زیادی جهت بهبود صفات زراعی این گیاه وجود دارد که مهندسی ژنتیک و استفاده از روش های انتقال ژن ازجمله آنها است. مهمترین آفت مزارع نیشکر در استان خوزستان، ساقه خوار سزامیا (.sesamia spp) می‏باشد و سالانه خسارت قابل توجهی به صورت کمی و کیفی به این محصول وارد می کند. استفاده از واریته های مقاوم به آفت و یا مقاوم سازی گیاه به آفات یکی از مهمترین روش های کنترل آفات محسوب می شود. در این تحقیق تلاش شد تا کلیه مراحل کشت بافت دو رقم تجاری نیشکر cp48-103 و cp69-1062، از برگ های پیچیده انتهایی ساقه بهینه سازی شود. بر اساس نتایج حاصل، شستشوی اولیه با آب، تیمار هیپوکلریت سدیم 5/2% به مدت 10 دقیقه و سپس الکل 70% با زمان یک دقیقه به همراه محیط کشت حاوی آنتی بیوتیک سفاتوکسیم به میزان 250 میلی گرم در لیتر بهترین شرایط سترون سازی نمونه ها است. برای تهیه نمونه های مناسب کشت، دو روش برش مورد بررسی قرار گرفت که روش برش استوانه از وسط، در مورد برگ های پیچیده انتهایی نسبت به تهیه رینگ از نتایج بهتری برخوردار بود. استفاده از محیط کشت ms جامد با تیمار 3 میلی گرم در لیتر از هورمون 2,4-d بهترین نتایج را برای تولید کالوس در پی داشت. استفاده از تیمار هورمونی naa به همراه iba نتوانست بافت کالوس مناسبی تولید کند. به منظور تولید شاخساره از کالوس ها، ترکیب هورمونی 1 میلی گرم در لیتر bap به همراه 2 میلی گرم در لیتر kinetin بهترین پاسخ دهی را داشت. گیاهچه های تولیدی در محیط ms حاوی تیمار 5 میلی گرم در لیتر iba به همراه 1 میلی گرم در لیتر kinetinو همین طور تیمار 3 میلی گرم در لیتر naaبه همراه 3 گرم در لیتر زغال فعال، بهترین شرایط برای ریشه دهی را داشتند. در تیمارهایی که از زغال فعال استفاده شده بود، گیاهچه های حاصل شده از نظر صفات اندازه گیری شده شامل: روز تا ظهور ریشه، طول ریشه و تعداد گیاهان به ریشه رفته، نتایج بهتری را نسبت به عدم استفاده از آن بدست آوردند. استفاده از انتقال ژن bt می-تواند یک راه موثر برای مقابله با آفات ساقه خوار به شمار رود. به این منظور، کالوس های حاصل از مریستم انتهایی دو رقم نیشکر cp48-103 و cp69-1062 جهت تراریختی به کمک agrobacterium tumefasiens سویه های eha105 و همچنین gv2260 استفاده شد. پس از هم کشتی، کالوس ها به محیط گزینشگر انتقال یافتند و بعد از گذشت 20 تا 25 روز، از جوانه های باززایی شده dna استخراج شد. آنالیز pcr، حضور ژن cry1ab را در برگ جوانه های مقاوم به هیگرومایسین، تایید کرد. جوانه های تراریخته باندی با اندازه bp1194 تولید کردند این در حالی بود که گیاهان غیرتراریخته (شاهد) هیچ باندی از خود نشان ندادند.